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如何選擇合適的單、多克隆抗體及抗原

更新時間:2018-07-14      點擊次數(shù):2348

  多克隆抗體(polyclonal antibody, pAb):用種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物,可刺激機(jī)體多個B細(xì)胞克隆,產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物,即多克隆抗體。單克隆抗體是由單B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均、僅針對某特定抗原表位的抗體,稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備,雜交瘤(hybridoma)抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上,將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B細(xì)胞雜交瘤。

、單多抗優(yōu)缺點

類型優(yōu)點缺點
多克隆抗體1.多克隆抗體有助于放大低表達(dá)水平的靶蛋白信號;                   
2.能識別多個表位;               
3.比單克隆抗體能容許抗原中的微小變化;                         
4.識別出與免疫原蛋白質(zhì)具有高同源性的蛋白質(zhì),或者從非免疫原物種的組織樣品中篩選靶蛋白;             
5.多克隆抗體通常是檢測變性蛋白質(zhì)的;                         
6.多表位通常可提供為有力的檢測。
1.易于產(chǎn)生批次間差異;                   
2.產(chǎn)生非特異性抗體,有時可能在某些應(yīng)用中產(chǎn)生背景信號;                       
3.不適用于探測抗原的特定結(jié)構(gòu)域,因為抗血清通常可識別多個結(jié)構(gòu)域。
單克隆抗體1.雜交瘤制得后,就成為了恒定的再生源,所有批次都將相同;            
2.切片和細(xì)胞染色造成的背景較低。
3.具有特異性,適于分析測定中的抗或檢測組織中的抗原,并且通常所產(chǎn)生的背景染色顯著低。                
4.同質(zhì)性非常高;                    
5.單克隆抗體的特異性能使其在混合物中和抗原地結(jié)合。
1.可產(chǎn)生特異性抗體,但可能特異性過強(qiáng);                                     
2.經(jīng)過抗原的化學(xué)處理后比多克隆抗體易于丟失表位。這可通過使用同抗原的兩個或多個單克隆抗體進(jìn)行補(bǔ)償。


二、單抗和多抗的選擇
    如果對抗體的特異性要求高,用量較大或需要使用致的抗體,制備的抗體應(yīng)用要求多(WB/IP/IF/ICC等),可以選擇制備單克隆抗體。

    多克隆抗體的特異性較差,即使是使用相同的抗原制備多抗,不同批次間也會存在差異,因而在特異性、致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫檢測時,容易造成背景,例如在WB 中有雜帶,在IHC 中背景較深等等。雖然還存在著交叉反應(yīng)的問題,但由于多抗識別多個抗原表位,即使是有少數(shù)幾個抗原表位被破壞或者抗原構(gòu)象改變,實驗的結(jié)果也不會受到影響。另外多抗需要免疫原的量大,如果免疫原制備困難,建議制備單抗。
    若對抗體的特異性要求不高,需要做沉淀和凝集反應(yīng)的檢測性實驗或者只需做ELISA檢測,可以選擇制備多克隆抗體。
    多抗相比較單抗仍然有制備時間短、制備成本低的特點,在些情況下也是種選擇。另外,在相同條件下,使用多抗可以提高檢測的靈敏度,對于豐度偏低的蛋白也容易檢出。

三、抗原的選擇
    抗原的選擇可以是天然蛋白、重組可溶蛋白、重組變性蛋白和多肽,抗原質(zhì)量越高,終制備高質(zhì)量抗體的幾率也會越大! 目前抗體制備常采用重組蛋白或多肽作為抗原。


   常規(guī)情況下,重組蛋白作為抗原往往含有多的抗原決定簇,既有空間表位,也會有線形序列表位,對于機(jī)體的免疫刺激也會相對充分些,那么終獲取應(yīng)用面較廣的抗體幾率也會大很多,尤其是目的蛋白已證明有修飾或者復(fù)雜結(jié)構(gòu)的,般都會優(yōu)先選擇重組蛋白。


   當(dāng)然也有必須用多肽制備的,比如對同源家族某個蛋白抗體的制備,同源性非常高的,需要找到特異性aa合成多肽,再或者些修飾化抗體,需要在多肽合成階段定點修飾某些AA來制備抗體。抗原多肽選擇般遵循如下基本原則1.盡可能是在蛋白表面;2.該段序列不形成α-helix;3.N,C端的肽段比中間的肽段好;4.避免蛋白內(nèi)部重復(fù)或接近重復(fù)段的序列;5.避免同源性太強(qiáng)的肽段;6.交聯(lián)可以交聯(lián)在N,C兩端,選擇依據(jù)就是交聯(lián)在對產(chǎn)生抗體不太重要的端;7.序列中不能有太多的Pro,但有兩個Pro有好處,可以使肽鏈結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定些,對產(chǎn)生特異性抗體有益。

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